Figlia di Lorenzo II de' Medici, duca di Urbino, era nipote del papa Clemente VII, che la propose al re di Francia Francesco I come moglie per il delfino Enrico, a cui andò sposa nel 1533, all'età di 14 anni.
Da Enrico ebbe dieci figli, di cui tre furono poi re di Francia: Francesco II, Carlo IX ed Enrico III.
Durante il regno del marito non ebbe alcun potere, in quanto il re era manovrato dall'amante, Diana di Poitiers, contessa di Chenonceau.
Quando però Enrico II fu ucciso durante un torneo, nel 1559, Caterina ottenne la Reggenza per il figlio adolescente Francesco II.
Da quel momento Caterina si vestì sempre di nero, per manifestare la propria condizione di vedova, e questo, assieme alla presenza di alcuni astrologi (tra cui Nostradamus) ed alchimisti, contribuì a creare il mito della Regina Nera, a cui venne attribuita la colpa di tutte le morti sospette, comprese quelle del marito e dei figli.
Dopo la morte del primogenito Francesco II, Caterina assunse la reggenza in nome del secondogenito Carlo IX.
In quegli anni era scoppiata in Francia la guerra civile tra i Cattolici e i protestanti Ugonotti.
Caterina, per quanto cattolica, preferì svolgere un ruolo di mediazione tra le parti, per garantire alla monarchia una superiorità rispetto alle varie fazioni e alle famiglie nobiliari che le rappresentavano: i cattolici duchi di Guisa e gli ugonotti, duchi di Borbone.
Per favorire una pacificazione, ma anche per controbilanciare il potere dei Guisa, Caterina diede sua figlia Margot in sposa ad Enrico di Borbone, re di Navarra.
Un famoso romanzo di Dumas, La Regina Margot, ricostruisce gli eventi gravissimi che avvennero dopo le nozze, nella notte tra il 23 e il 24 agosto 1572, passata alla storia come la Notte di San Bartolomeo, in cui a Parigi e in tutta la Francia, furono uccisi 30.000 ugonotti.
Il romanzo, come anche il film che ne è stato tratto, con Virna Lisi nella parte di Caterina, tende ad avvalorare la Leggenda Nera secondo cui la regina vedova avrebbe convinto il figlio Carlo IX a dare l'ordine della strage per prevenire un complotto da parte del protestante ammiraglio di Coligny.
L'unica cosa certa è che Enrico di Borbone dovette abiurare, cioè sciogliere il giuramento di fedeltà alla fede protestante. Successivamente Enrico avrebbe detto, secondo la tradizione, le parole "Parigi val bene una messa", facendo intendere che quella conversione gli avrebbe garantito la successione al trono, in quanto cugino degli ultimi Valois e marito della principessa Margot.
Sul momento parve che la strage della notte di San Bartolomeo avesse posto fine alle guerre di religione.
In questo quadro, Caterina viene dipinta come trionfatrice, quando, la mattina del 25 agosto, uscì dal castello reale del Louvre, assieme alla famiglia e alla corte, per verificare l'accaduto:
In realtà, dopo la morte di Carlo IX, quando il figlio preferito di Caterina, il duca d'Anjou Enrico III divenne re, scoppiò una nuova guerra, detta dei tre Enrichi, in quanto vide contrapposti, oltre al re Enrico III, il duca Enrico di Guisa e il duca Enrico di Borbone.
Gli eventi precipitarono quando Enrico III, contravvenendo al parere di Caterina, si schierò contro Enrico di Guisa, che venne ucciso nel dicembre del 1588.
Per prendere le distanze da questo atto, Caterina si ritirò nel castello di Blois.
Consapevole dell'imminente fine della dinastia dei Valois, Caterina rinunciò a qualsiasi atto politico, e dopo poche settimane morì di polmonite nel gennaio 1589.
Pochi mesi dopo Enrico III fu ucciso ed Enrico IV di Borbone divenne re di Francia, dando inizio ad una nuova dinastia.